如何選擇合適的液相色譜柱
怎樣挑選色譜柱
現(xiàn)代液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的挑選。可是色譜填料的挑選規(guī)模很寬，要做適宜的挑選，有必要對(duì)此有一定的認(rèn)識(shí)和了解。
1、正相色譜
正相色譜用的固定相一般為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán)(NH2,APS)和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。因?yàn)楣枘z外表的硅羥基（SiOH）或其他團(tuán)的極性較強(qiáng)，因而，分離的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性巨細(xì)，即極性強(qiáng)弱的組份被沖刷譜柱。正相色譜運(yùn)用的活動(dòng)相極性相比照固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反相色譜
反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，外表鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所運(yùn)用的活動(dòng)相極性較強(qiáng)，一般為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。樣品流譜柱的次序是極性較強(qiáng)組合被沖出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保存。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。
二、聚合物填料
聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1～14均可運(yùn)用。相對(duì)與硅膠基質(zhì)的C18填料，這類(lèi)填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物填料對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常。現(xiàn)在的聚合物填料的缺陷是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。
三、其他無(wú)機(jī)填料
其它HPLC的無(wú)機(jī)填料色譜柱也現(xiàn)已商品化。因?yàn)槠涮貏e的性質(zhì)，一般于特別的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的外表即是保存的基礎(chǔ)，不再需其它的外表改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保存才能更強(qiáng)，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又因?yàn)镠PLC活動(dòng)相中不會(huì)被溶解，這類(lèi)柱可在任何PH與溫度下運(yùn)用。氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成安穩(wěn)的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可在PH高達(dá)12的活動(dòng)相中運(yùn)用。但因?yàn)檠趸X與堿性化合物作用也很強(qiáng)，運(yùn)用規(guī)模遭到一定的限制，所以未能廣泛運(yùn)用，新式氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，運(yùn)用PH規(guī)模1～14，溫度可達(dá)100℃。因?yàn)檠趸喬盍蠋啄瓴砰_(kāi)始研討，加之面臨的試驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行中。
怎樣挑選填料粒度
現(xiàn)在，商品化的色譜料粒度從1um到超越30um均有出售，而現(xiàn)在剖析分離主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個(gè)參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料運(yùn)用，在相同挑選性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是的要素。假如固定相挑選是正確，可是分離度不夠，那么挑選更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱數(shù)比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；但是，3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時(shí)，柱效提高意味著在相同條件下可以挑選更短的色譜柱，以縮短剖析時(shí)間，另外，可以采用低粘度的溶劑做活動(dòng)相或添加色譜柱的運(yùn)用溫度，比如用乙腈替代甲醇，以下降色譜柱的壓力。
一、怎么杰出的柱性能與柱壽數(shù)
◆ 認(rèn)證閱讀色譜柱運(yùn)用說(shuō)明書(shū)；
◆ 運(yùn)用填充杰出的色譜柱；
◆ 盡量削減壓力波動(dòng)，防止機(jī)械及熱沖擊；
◆ 運(yùn)用維護(hù)柱及在線過(guò)濾器；
◆ 經(jīng)常以強(qiáng)溶劑沖刷色譜柱；
◆ 充分過(guò)濾樣品及活動(dòng)相，盡量防止雜質(zhì)微粒與強(qiáng)保存成分；
◆ 用安穩(wěn)的固定相（C18*安穩(wěn)）；
◆ 在中等PH值操作（6~8），用有機(jī)緩沖溶液；
◆ 色譜柱運(yùn)用溫度小于40℃；
◆ 硅膠基質(zhì)的的色譜柱，應(yīng)保持活動(dòng)相的PH值規(guī)模在3.0~8.0；
◆ 在水活動(dòng)相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；
◆ 活動(dòng)相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意應(yīng)95∶5的水及有機(jī)溶劑過(guò)渡，有機(jī)溶劑不能低于5%；
◆ 過(guò)夜或貯存時(shí)，沖刷掉鹽和緩沖液，用純有機(jī)溶劑活動(dòng)相保存（乙晴）。
HPLC固定相及應(yīng)用范圍
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名稱 別名 功能基團(tuán) 正相 反相 離子對(duì) 應(yīng)用 |
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Silica -OH √ 非極性和中等極性以及非離子性有機(jī)化合物。 |
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SAS C1 -(CH3)3 √ 在所有的烷基鍵合相中對(duì)非極性化合物保留* 弱，典型用于中等極性和多官能團(tuán)化合物. |
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Butyl C4 -C4H9 √ √ 分離肽和蛋白質(zhì)，保留時(shí)間比C8和C18短。 |
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MOS C8， -C8H17 √ √ 中等極性相中對(duì)中等化合物，小肽和蛋白質(zhì)， Octyl 極性藥族化合物和環(huán)境樣品。 |
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ODS C18 -C18H37 √ √ 烷基鍵合相中對(duì)中等極性化合物保留*強(qiáng)。廣 泛用于藥物，甾族化合物，脂肪酸和環(huán)境樣品. |
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CPS CN ,Cyano -(CH2)3CN √ √ 對(duì)極性化合物有獨(dú)特的選擇性，適合應(yīng)用于正相 (propyl 分離，當(dāng)用于反相系統(tǒng)時(shí)，其選擇性與 C8和 Nitrile) C18不同，在藥學(xué)領(lǐng)域和復(fù)雜混合物的分離中應(yīng) 用廣泛。 |
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APS NH2 -(CH2)3 NH2 √ √ 反相中分析糖類(lèi)和其他極性化合物。弱陰離子交 (Amino Propyl) 換 ，陰離子和有機(jī)酸則應(yīng)用緩沖劑和有機(jī)改性 劑 做流動(dòng)相。正相中與硅膠的選擇性機(jī)改性劑 不同,分析芳香族效果很好。 |
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Phenyl -(CH3)C6H5 √ √ 芳香族化合物 |
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Diol -(CH2)2O √ √ 反相時(shí)，分離肽和蛋白質(zhì)。正相時(shí)，與硅選擇 CH2(CH2OH)2 性 相似,但極性較弱。 |
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SCX 強(qiáng)陽(yáng)離子 -(CH2)2C6H4SO3H- √ 有機(jī)堿 交換 |
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SAX 強(qiáng)陰離子 -(CH2)3N+(CH3)3 有機(jī)酸，核苷和核苷酸 交換 |
二、如何解決色譜柱使用過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題
1.保留值與分離度重現(xiàn)性不好原因分析
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問(wèn)題 原因 表現(xiàn) |
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不同色譜柱間差異 填料、鍵合相不同 保留因子（k），分離因子（α） 使用期間柱變化 柱床破壞 柱效（N） 鍵合相丟失 保留因子（k），分離子（α） 硅膠基質(zhì)溶解 柱效（N） 強(qiáng)保留分堆積堵塞 保留因子（k），柱效（N） |
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柱外效應(yīng) 系統(tǒng)差異，進(jìn)樣量大、 柱效（N） 進(jìn)樣閥與 色譜柱之間、 色譜柱與檢測(cè)器之間管 路太長(zhǎng)、檢測(cè)器流通池 體積大、接頭死體積大 等。 |
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分離效果變差 流動(dòng)相組分改變 保留因子（k），柱效變化很小 流速改變 保留因子（k），分離因子（α） 溫度改變 保留因子（k），柱效變化很小 |
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柱平衡慢 重新平衡時(shí)間不夠 保留因子（k），柱效變化很小 |
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柱超載 樣品量太大 保留因子（k），柱效（N） |
2.造成色譜峰（不對(duì)稱）拖尾的原因
1.色譜柱本身填裝問(wèn)題，篩板堵塞或填料塌陷；
2.柱頭有污染；
3樣品超載；
4樣品溶劑不合適；
5.柱外效應(yīng)；
6化學(xué)或二次保留（硅羥基）效應(yīng)；
7緩沖容量不足或不合適；
8重金屬污染。
3.如何解決峰形拖尾的問(wèn)題
A．與化學(xué)有關(guān)的拖尾問(wèn)題
1．流動(dòng)相中，加入30mM的三乙胺（用與堿性化合物）或醋酸胺（用與酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺；
2．如仍然拖尾，將三乙胺換為二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；
3．降低進(jìn)樣量至<1ug。
B．與色譜柱有關(guān)的拖尾問(wèn)題
1．如柱頭處有強(qiáng)保留的樣品組分積聚，反相柱可用20倍柱體積的96%的二碌甲烷與4%甲醇，加1%氫氧化銨混合液沖洗，正向柱可用甲醇沖洗。
2．使用保護(hù)柱
C．與HPLC 系統(tǒng)有關(guān)的峰拖尾和峰加寬
1．進(jìn)樣體積過(guò)大，（通常≤25uL）；
2．進(jìn)樣閥與色譜柱及檢測(cè)器之間的管路體積過(guò)大（連接管應(yīng)<20cm，內(nèi)徑為0.007″）；
3．檢測(cè)器流通池的體積過(guò)大。
4．如何儲(chǔ)存色譜柱
1．防止緩沖溶液和水溶液流動(dòng)相產(chǎn)生微生物，做到流動(dòng)相用多少配多少，或在水流動(dòng)相中加200ppm的疊氮鈉以抑制細(xì)菌成長(zhǎng)（一定當(dāng)心其毒性和潛在的爆炸性）；或在流動(dòng)相中加20%的有機(jī)改性劑，也可抑制微生物生長(zhǎng)，有機(jī)改性劑還有助于流動(dòng)相脫氣。
2．盡可能將色譜柱貯存于100%有機(jī)溶劑（乙晴）中，避免在緩沖溶液中保存。
3．使用緩沖溶液后的色譜柱，應(yīng)用15～20倍柱體積的不含緩沖劑的同種水—有機(jī)溶劑流動(dòng)相沖洗色譜柱，后換成100%有機(jī)溶劑儲(chǔ)存。
4．避免用純凈水沖洗鍵合致密的C18柱。
5．將色譜柱的兩端用堵頭擰好，以免柱床填料干裂。
如何選擇保護(hù)柱
怎樣選擇保護(hù)柱，但又不能影響分離分析？這是色譜工作者經(jīng)常提出的一個(gè)問(wèn)題。通常，在選擇保護(hù)柱之前首先要考慮的是樣品是否清潔。對(duì)于大部分分析工作者來(lái)說(shuō)，一只1cm長(zhǎng)的保護(hù)柱，那么就應(yīng)選擇2cm或3cm長(zhǎng)的保護(hù)柱。保護(hù)柱越長(zhǎng)，自然所裝填的色譜填料就越多，則其越能避免污染物進(jìn)入分析色譜柱的機(jī)會(huì)。當(dāng)然，隨著保護(hù)柱的長(zhǎng)度加長(zhǎng)，樣品的保留時(shí)間會(huì)比使用短保護(hù)柱長(zhǎng)。
一般來(lái)說(shuō)，保護(hù)柱的內(nèi)徑與分析色譜柱的內(nèi)徑相同或相當(dāng)即可。保護(hù)柱的填料裝填方式也很重要。目前有薄膜裝填法的保護(hù)柱，使用過(guò)程很簡(jiǎn)單方便，而且可以在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行干裝。但是，其的缺點(diǎn)是不經(jīng)濟(jì)，特別是針對(duì)中國(guó)的具體情況，一次性使用相對(duì)費(fèi)用較高。另外，薄膜裝填法的保護(hù)柱所裝填的色譜填料有限，只能提供有限的保護(hù)作用；不過(guò)也因?yàn)樗b填的色譜料較少，保護(hù)柱的長(zhǎng)度也較短，所以對(duì)分析樣品的保留時(shí)間的影響也很小。
另一種保護(hù)柱結(jié)構(gòu)其實(shí)質(zhì)是縮短了的色譜分析拄，設(shè)計(jì)方式上有直連式、手緊式或整體式。整體式設(shè)計(jì)是由色譜的生產(chǎn)廠商直接安裝在色譜分析柱上的，必須與色譜分析柱一同訂貨，可以非常方便地使用，但不能夠被修改。直連式結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可在任何時(shí)候有色譜工作者來(lái)安裝連接，可以與任何品牌的色譜分析柱連接使用，而且還可以根據(jù)樣品的相關(guān)情況選擇不同的保護(hù)柱長(zhǎng)度。手上緊即可。
另外從保護(hù)柱結(jié)構(gòu)又分為是否可以更換保護(hù)柱柱芯。可以降低保護(hù)柱的使用成本。大多數(shù)人是根據(jù)色譜分析柱的填料選擇保護(hù)柱的填料，正常情況下可以選擇與分析色譜柱一樣的色譜填料。但是，根據(jù)實(shí)際的分析工作，也可不必與分析色譜柱的填料相匹配。對(duì)于選擇保護(hù)柱的原則是：在滿足分析分離要求的前提條件下，盡可能的選擇較短的保護(hù)柱結(jié)構(gòu)，盡可能選擇對(duì)分離樣品小一些保留性的填料。
儀器的主要功能和應(yīng)用:
LC600A 高效液相色譜儀
LC600A 高效智能全控液相色譜儀由 P600 高壓恒流泵與 UV600 紫外檢測(cè)器直接構(gòu)成等度 / 梯度分析系統(tǒng)。使用 WS600 工作站可以同時(shí)控制數(shù)臺(tái) P600 高壓恒流泵、UV600 紫外檢測(cè)器及恒溫柱箱等，實(shí)行多元高壓洗脫、波長(zhǎng)掃描等功能。
特點(diǎn)：
?LC-P600高壓恒流泵
（1）往復(fù)式并聯(lián)泵設(shè)計(jì)，流量精度高，壓力脈動(dòng)小，延長(zhǎng)密封圈和 活塞桿的使用壽命；
（2）隔膜式秒沖阻尼器與電子脈動(dòng)抑制技術(shù)同時(shí)控制壓力脈動(dòng)保障 最低的基線噪音；
（3）整體性單向閥，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，密封性好；
（4）柱塞桿自動(dòng)縮進(jìn)，方便更換密封圈；
（5）可選配注后清洗功能，適用于使用含緩沖鹽的分析條件。
?UV600紫外檢測(cè)器
（1）平行雙錐孔設(shè)計(jì)的流動(dòng)池，大幅提高信噪比，檢測(cè)效果更佳；
（2）開(kāi)機(jī)自檢功能，通過(guò)圖譜上486.6nm和656nm這二點(diǎn)的位置， 以判斷波長(zhǎng)示值誤差的準(zhǔn)確性，保證極優(yōu)的波長(zhǎng)精度，保障儀器最佳狀態(tài)；
（3）控制電路采用多微處理器結(jié)構(gòu)，分別管理信號(hào)采集、數(shù)據(jù)處理、 系統(tǒng)控制和通信。在做等度分析時(shí)，可以方便的通過(guò)全漢字的液晶屏與七 個(gè)功能鍵，設(shè)置波長(zhǎng)、濾波常數(shù)、輸出量程、運(yùn)行時(shí)間等參數(shù)。并且可以 實(shí)現(xiàn)開(kāi)關(guān)氘燈，光譜掃描，啟動(dòng)分析程序等功能；
（4）全數(shù)字交換系統(tǒng)，避免了色譜信號(hào)需要多重模-數(shù)轉(zhuǎn)換帶來(lái)的 信號(hào)畸變與干擾。
?WS600色譜工作站
（1）具有液相色譜系統(tǒng)控制和色譜數(shù)據(jù)處理雙重功能；
（2）六種定量計(jì)算方法；
（3）多重不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)試樣校準(zhǔn)運(yùn)行，建立樣品濃度-面積校正曲線；
（4）靈活的峰識(shí)別和處理能力；
（5）色譜圖形、定量計(jì)算方式、峰處理參數(shù)及峰鑒定表等可保存到用戶自命名的文件中。
?具有自動(dòng)在線檢測(cè)功能
液相色譜原理:儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相由高壓泵泵入系統(tǒng)，樣品溶液通過(guò)注射器進(jìn)入流動(dòng)相，流動(dòng)相裝柱(固定相)。由于樣品溶液中的組分在兩相中的分配系數(shù)不同，當(dāng)它們相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，會(huì)經(jīng)歷重復(fù)的時(shí)間。在吸附-解吸分配過(guò)程中，各組分的移動(dòng)速度差異很大。它被分離成單一組分，依次流出色譜柱。當(dāng)通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)并傳輸?shù)接涗泝x。這些數(shù)據(jù)可以用圖表的形式打印出來(lái)，供研究人員分析。
丨關(guān)于南京科捷
南京科捷檢測(cè)科技發(fā)展有限公司作為實(shí)驗(yàn)室色譜領(lǐng)域的知名企業(yè)，在近 20年的技術(shù)創(chuàng)新歷史中，一直致力于幫助科學(xué)家和實(shí)驗(yàn)室分析人員解決復(fù)雜的分析問(wèn)題。
我們?yōu)榭茖W(xué)家和實(shí)驗(yàn)室分析人員在 GC、GCMS、LC、AAS、ICP、UV 等領(lǐng)域提供方案，并在其日常檢測(cè)中提供技術(shù)支持，經(jīng)過(guò) 16 年的沉淀與積累，逐漸贏得客戶信賴。
南京科捷專(zhuān)注于食品安全、環(huán)境衛(wèi)生和能源化工等領(lǐng)域，為行業(yè)提供方案，為客戶提供信心，讓人們的生活更美好是我們始終堅(jiān)信的使命。
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